Búsqueda de nuevos genes asociados a la diabetes neonatal

240 p.El objetivo principal del presente trabajo ha sido identificar las alteraciones genéticas responsables de la diabetes neonatal o de comienzo precoz en pacientes sin alteraciones potencialmente patológicas en genes clásicamente asociados a la enfermedad. Para llevar a cabo este estudio, inicialmente se realizó un estudio genético de los genes clásicamente asociados a la diabetes neonatal en nuestra cohorte de pacientes. Tras realizar la secuenciación de dichos genes y descartar mutaciones que pudieran explicar la clínica de los pacientes, se seleccionaron ocho pacientes para realizar un estudio de exoma completo con el fin de identificar nuevas mutaciones asociadas con la enfermedad. Por último, se realizó el estudio funcional de una de las alteraciones identificadas en el análisis del exoma con el fin de establecer el impacto funcional de dicha variante en la patogénesis de la enfermedad a nivel de célula ¿ pancreática.En nuestra cohorte de 42 pacientes, el estudio estructural de los genes ABCC8, KCNJ11 e INS y el estudio de la región 6q24 revelaron alteraciones en 30 de los afectos (71%). La patogenicidad de las mutaciones se demostró usando los software de predicción y la cosegregación de la mutación en la familia. En doce pacientes (29%) no se detectaron mutaciones en ninguno de los genes analizados. Estos resultados concuerdan con otros estudios realizados previamente, en los que entre un 20 y un 40% de los pacientes con diabetes neonatal no presentaron mutaciones en los genes clásicamente asociados con la diabetes neonatal. Un 43% de los pacientes presentaba alteraciones en los genes que codifican para los canales de potasio (KCNJ11 y ABCC8), mientras que el 30% portaba alteraciones en la región 6q24 y un 23% en el gen de la insulina. Además, en uno de los pacientes que además de padecer diabetes neonatal tenía un cuadro poliglandular autoinmune caracterizado por enteropatía y autoinmunidad tiroidea, detectamos una alteración en el gen FOXP3, que ha sido previamente asociado al síndrome IPEX, un cuadro multisitémico autoinmune que incluye las patologías que padecía el paciente (enteropatía que causa diarrea severa y desnutrición, eczema, autoinmunidad tiroidea, etc.). En concordancia con la prevalencia descrita por otros autores, la mayoría de los casos de diabetes neonatal permanente presentan alteraciones en los canales de potasio, siendo las alteraciones en la insulina la segunda causa mas común. También de acuerdo con otros estudios, los pacientes con DNT de nuestra cohorte presentan mayoritariamente alteraciones en la región 6q24. Teniendo en cuenta las características clínicas de nuestros pacientes, concretamente la edad al diagnóstico y el peso al nacimiento, podemos concluir que en nuestra cohorte, los pacientes con alteraciones en la región 6q24 son los que muestran una clínica más característica. Estos pacientes tienen un menor peso al nacimiento y son diagnosticados en los primeros días de vida, mientras que los pacientes con alteraciones en los canales de potasio o en el gen de la insulina tienen un peso al nacimiento más alto y pueden ser diagnosticados hasta 6 meses después del nacimiento. A la hora de realizar estudios de diagnóstico genético, estas diferencias en las características clínicas pueden ser orientativas de qué genes pueden estar alterados y por tanto, pueden utilizarse para priorizar el análisis de un gen en concreto. En una segunda fase, seleccionamos ocho pacientes en los que no detectamos mutaciones en los genes clásicamente asociados a diabetes neonatal, y realizamos un estudio de exoma completo con la intención de identificar mutaciones potencialmente patogénicas. Gracias al estudio de exoma, identificamos cinco variantes potencialmente patogénicas que podrían explicar la patogénesis de la enfermedad en dichos pacientes (62%). Por último, realizamos la caracterización funcional de una de las variantes y demostramos que tiene un impacto deletéreo en la función de la célula ¿ pancreática y que por lo tanto puede ser la responsable de la clínica de la paciente que la porta. En concreto, el estudio funcional realizado a nivel de célula ¿ pancreática demostró que la mutación P330S en el gen STAT3 identificada en una de las familias gracias al estudio de exoma completo conducía a una disminución de la síntesis de insulina en las células ß pancreáticas y que podría ser la responsable directa del desarrollo de la diabetes neonatal en la paciente portadora de la mutación. Este factor de transcripción inhibía la expresión del factor de transcripción Isl-1, implicado a su vez en la regulación de la expresión de la insulina. De la misma manera, observamos que la inhibición de la expresión de Isl-1 provocada por la mutación en STAT3 resultaba en una disminución en la expresión de la insulina y en una disminución drástica en la secreción de insulina estimulada por glucosa. Aunque el resto de mutaciones identificadas han sido etiquetadas como patogénicas en los análisis de predicción in silico, es necesario realizar estudios funcionales para esclarecer su verdadero impacto en la patogénesis de la enfermedad. Concluimos por tanto que mediante el estudio de los genes clásicamente asociados a diabetes neonatal se resuelven alrededor del 70% de los casos de diabetes neonatal, por lo que el análisis estructural de estos genes debería considerarse siempre que exista sospecha de diabetes neonatal. Además del análisis estructural de las regiones codificantes de los genes asociados a diabetes monogénica, para optimizar el diagnóstico genético de la diabetes neonatal se deberían analizarlas regiones intrónicas y regiones UTR de dichos genes, ya que alteraciones en esas regiones están asociadas con el desarrollo de la patología. También inferimos que la edad al diagnóstico, el peso al nacimiento y el tipo de diabetes neonatal (permanente o transitoria) son características clínicas que se deben tener en cuenta para orientar el estudio genético y priorizar el análisis de unos genes sobre otros. Por otro lado, teniendo en cuenta que un correcto diagnóstico genético de la diabetes neonatal puede suponer una mejora en el tratamiento, es importante optimizar los métodos de diagnóstico. Así, los análisis de exoma completo serían una herramienta útil para aumentar la eficacia del diagnóstico genético de la diabetes neonatal. Aun así, debemos tener en cuenta que para confirmar la patogenicidad de las mutaciones identificadas mediante análisis del exoma completo, es necesario realizar estudios funcionales. En este sentido, los resultados de este trabajo demuestran que la mutación activante identificada en el factor de transcripción STAT3 inhibe la síntesis y secreción de insulina y por tanto, puede ser la responsable etiológica del desarrollo de la DN en la paciente portadora de la misma

Búsqueda de nuevos genes asociados a la diabetes neonatal

240 p.El objetivo principal del presente trabajo ha sido identificar las alteraciones genéticas responsables de la diabetes neonatal o de comienzo precoz en pacientes sin alteraciones potencialmente patológicas en genes clásicamente asociados a la enfermedad. Para llevar a cabo este estudio, inicialmente se realizó un estudio genético de los genes clásicamente asociados a la diabetes neonatal en nuestra cohorte de pacientes. Tras realizar la secuenciación de dichos genes y descartar mutaciones que pudieran explicar la clínica de los pacientes, se seleccionaron ocho pacientes para realizar un estudio de exoma completo con el fin de identificar nuevas mutaciones asociadas con la enfermedad. Por último, se realizó el estudio funcional de una de las alteraciones identificadas en el análisis del exoma con el fin de establecer el impacto funcional de dicha variante en la patogénesis de la enfermedad a nivel de célula ¿ pancreática.En nuestra cohorte de 42 pacientes, el estudio estructural de los genes ABCC8, KCNJ11 e INS y el estudio de la región 6q24 revelaron alteraciones en 30 de los afectos (71%). La patogenicidad de las mutaciones se demostró usando los software de predicción y la cosegregación de la mutación en la familia. En doce pacientes (29%) no se detectaron mutaciones en ninguno de los genes analizados. Estos resultados concuerdan con otros estudios realizados previamente, en los que entre un 20 y un 40% de los pacientes con diabetes neonatal no presentaron mutaciones en los genes clásicamente asociados con la diabetes neonatal. Un 43% de los pacientes presentaba alteraciones en los genes que codifican para los canales de potasio (KCNJ11 y ABCC8), mientras que el 30% portaba alteraciones en la región 6q24 y un 23% en el gen de la insulina. Además, en uno de los pacientes que además de padecer diabetes neonatal tenía un cuadro poliglandular autoinmune caracterizado por enteropatía y autoinmunidad tiroidea, detectamos una alteración en el gen FOXP3, que ha sido previamente asociado al síndrome IPEX, un cuadro multisitémico autoinmune que incluye las patologías que padecía el paciente (enteropatía que causa diarrea severa y desnutrición, eczema, autoinmunidad tiroidea, etc.). En concordancia con la prevalencia descrita por otros autores, la mayoría de los casos de diabetes neonatal permanente presentan alteraciones en los canales de potasio, siendo las alteraciones en la insulina la segunda causa mas común. También de acuerdo con otros estudios, los pacientes con DNT de nuestra cohorte presentan mayoritariamente alteraciones en la región 6q24. Teniendo en cuenta las características clínicas de nuestros pacientes, concretamente la edad al diagnóstico y el peso al nacimiento, podemos concluir que en nuestra cohorte, los pacientes con alteraciones en la región 6q24 son los que muestran una clínica más característica. Estos pacientes tienen un menor peso al nacimiento y son diagnosticados en los primeros días de vida, mientras que los pacientes con alteraciones en los canales de potasio o en el gen de la insulina tienen un peso al nacimiento más alto y pueden ser diagnosticados hasta 6 meses después del nacimiento. A la hora de realizar estudios de diagnóstico genético, estas diferencias en las características clínicas pueden ser orientativas de qué genes pueden estar alterados y por tanto, pueden utilizarse para priorizar el análisis de un gen en concreto. En una segunda fase, seleccionamos ocho pacientes en los que no detectamos mutaciones en los genes clásicamente asociados a diabetes neonatal, y realizamos un estudio de exoma completo con la intención de identificar mutaciones potencialmente patogénicas. Gracias al estudio de exoma, identificamos cinco variantes potencialmente patogénicas que podrían explicar la patogénesis de la enfermedad en dichos pacientes (62%). Por último, realizamos la caracterización funcional de una de las variantes y demostramos que tiene un impacto deletéreo en la función de la célula ¿ pancreática y que por lo tanto puede ser la responsable de la clínica de la paciente que la porta. En concreto, el estudio funcional realizado a nivel de célula ¿ pancreática demostró que la mutación P330S en el gen STAT3 identificada en una de las familias gracias al estudio de exoma completo conducía a una disminución de la síntesis de insulina en las células ß pancreáticas y que podría ser la responsable directa del desarrollo de la diabetes neonatal en la paciente portadora de la mutación. Este factor de transcripción inhibía la expresión del factor de transcripción Isl-1, implicado a su vez en la regulación de la expresión de la insulina. De la misma manera, observamos que la inhibición de la expresión de Isl-1 provocada por la mutación en STAT3 resultaba en una disminución en la expresión de la insulina y en una disminución drástica en la secreción de insulina estimulada por glucosa. Aunque el resto de mutaciones identificadas han sido etiquetadas como patogénicas en los análisis de predicción in silico, es necesario realizar estudios funcionales para esclarecer su verdadero impacto en la patogénesis de la enfermedad. Concluimos por tanto que mediante el estudio de los genes clásicamente asociados a diabetes neonatal se resuelven alrededor del 70% de los casos de diabetes neonatal, por lo que el análisis estructural de estos genes debería considerarse siempre que exista sospecha de diabetes neonatal. Además del análisis estructural de las regiones codificantes de los genes asociados a diabetes monogénica, para optimizar el diagnóstico genético de la diabetes neonatal se deberían analizarlas regiones intrónicas y regiones UTR de dichos genes, ya que alteraciones en esas regiones están asociadas con el desarrollo de la patología. También inferimos que la edad al diagnóstico, el peso al nacimiento y el tipo de diabetes neonatal (permanente o transitoria) son características clínicas que se deben tener en cuenta para orientar el estudio genético y priorizar el análisis de unos genes sobre otros. Por otro lado, teniendo en cuenta que un correcto diagnóstico genético de la diabetes neonatal puede suponer una mejora en el tratamiento, es importante optimizar los métodos de diagnóstico. Así, los análisis de exoma completo serían una herramienta útil para aumentar la eficacia del diagnóstico genético de la diabetes neonatal. Aun así, debemos tener en cuenta que para confirmar la patogenicidad de las mutaciones identificadas mediante análisis del exoma completo, es necesario realizar estudios funcionales. En este sentido, los resultados de este trabajo demuestran que la mutación activante identificada en el factor de transcripción STAT3 inhibe la síntesis y secreción de insulina y por tanto, puede ser la responsable etiológica del desarrollo de la DN en la paciente portadora de la misma

Análisis de los cambios epigenéticos en la metilación del DNA inducidos por la diabetes y sus posibles mecanismos

Los cambios epigenéticos son responsables de la aparición de muchas patologías humanas y sus causas son debido a factores ambientales como genéticos. Se ha descrito en enfermedades crónicas como la Diabetes Mellitus tipo 2 (T2DM) que se caracteriza por los estados de hiperglucemia y el incremento en el estrés oxidativo que conlleva a complicaciones micro y macro vasculares, asociado a una desmetilación global del genoma. Nuestra hipótesis corresponde a que los órganos diana son afectados por las alteraciones como la metilación e hidroximetilación como consecuencia del estrés oxidativo que luego repercuten en la persistencia de la enfermedad. Métodos: A partir de sangre periférica se analizaron los cambios globales en la metilación del DNA que son afectados por el estado metabólico de 60 individuos (40 pacientes, 20 controles sanos). Por técnicas de cuantificación se compararon los resultados obtenidos con los de la expresión de las enzimas involucradas. Por último, se realizó un estudio de microarreglos de metilación del DNA y de expresión obtenidos de la base de datos GEO para así comparar los resultados con nuestros datos experimentales. Resultados: Los pacientes diabéticos con pobre control metabólico presentaron mayores niveles de metilación que el grupo control y no se encontró alteración en las enzimas involucradas en este proceso. Los resultados fueron concordantes con el estudio de microarreglos. Conclusión: Los estudios experimentales y de microarreglos demostraron que la metilación es tejido específico y que existe una mayor oxidación en pacientes. Por ello proponemos una vía alterna de desmetilación no enzimática, basada en la oxidación directa de los grupos metilos generados por los estados oxidativos característicos de esta enfermedad

MiARNs angiogénicos en la regulación del tejido adiposo y su relación con el desarrolo de la resistencia a la insulina asociada a la obesidad

Para llevar a cabo estos objetivos se utilizaron muestras humanas de TA visceral y subcutáneo y sistemas celulares in vitro e in vivo. In vitro, utilizamos células de una línea celular de preadipocitos, las células 3T3-L1. Los experimentos in vivo fueron realizados en ratones de la cepa C57BL-6J los cuales fueron alimentados con dieta alta en grasa para obtener un modelo de ratón con obesidad inducida por dieta. Los resultados nos han permitido determinar que en TA visceral y subcutáneo humano, la expresión de miR-15b, miR-20a, miR-20b, miR-27b, miR-126, miR-130a, miR-27, miR-221, miR-222, miR-296 y Let-7f están influenciados por obesidad y diabetes, cuando estos factores se presentan conjuntamente en un modo específico de depósito de grasa, Además, la interacción entre obesidad, TA, DMT2 y un grupo de microARNs formado por miR-20b, miR-296 y Let-7f, podrían estar involucrados en las vías de señalización de angiogénesis y Wnt por la regulación de seis genes diana: CDKN1A, CX3CL1, HIF1A, PPP2R1B, STAT3 y VEGFA. miR-221 y miR-222 parecen estar regulando DVL2 e IL1RAP en relación a la obesidad y la resistencia a la insulina. Además, las modificaciones que afectan la metilación de los genes CPS1, ELMO1, STEAP3, IQCE y MGDA1 parecen estar asociadas a la DMT2 en el estado de obesidad. Fecha de lectura de Tesis: 27 Septiembre 2018Según los últimos datos emitidos por la Organización Mundial de la Salud, la obesidad ha alcanzado proporciones epidémicas a nivel mundial. El incremento del índice de masa corporal puede conducir al desarrollo de otras enfermedades, y aumentar el riesgo de desarrollar resistencia a la insulina (RI) y diabetes mellitus tipo 2 (DMT2). La obesidad se caracteriza por un aumento excesivo de grasa como resultado de un balance energético positivo y por la presencia de inflamación de bajo grado. La relación entre estas patologías está bien establecida, sin embargo, los mecanismos que conducen a ellas no están totalmente definidos. El crecimiento del tejido adiposo (TA) puede producirse por hiperplasia o por hipertrofia, dos mecanismos complejos cuyos principales factores son adipogénesis, apoptosis y angiogénesis. Estudios recientes sugieren que una alteración en la capacidad de expansión o funcionalidad del TA puede conducir a que el exceso de grasa se deposite en otros órganos y esto aumentar el riesgo al desarrollo de comorbilidades asociadas a la obesidad. Los objetivos de este estudio fueron 1) Analizar el nivel de expresión de 11 miARNs angiogénicos en tejido adiposo humano en relación con obesidad y DMT2, 2) realizar un análisis bioinformático para determinar los genes diana de estos miARNs, clasificarlos para saber en qué procesos biológicos intervienen y crear una red de interacción para relacionar a los microARNs con sus genes diana y las vías de señalización en las cuales están involucrados, 3) estudiar el efecto que ejercen estos microARNs sobre sus genes dianas, incluyendo un análisis de metilación de ADN

Estudio de regiones génicas relacionadas con el estrés oxidativo: papel en la artrosis

Programa Oficial de Doutoramento en Ciencias da Saúde. 5007V01[Abstract] Osteoarthritis is the most prevalent and incapacitating rheumatic disease worldwide and currently there isn’t any effective treatment for it. Initially, it manifests itself at the molecular level, generating anatomical and / or physiological alterations. The role of epigenetics is crucial to understand the gene-environment interaction in complex diseases, and recently, different patterns of methylation have been linked to osteoarthritis. On the other hand, mitochondria has played an important role because of its importance in cell detoxification and mitochondrial haplogroups have been shown to influence the predisposition and progression of the disease. This study has focused on the search for new genetic regions related to oxidative stress with potential value as therapeutic targets or disease biomarkers and independent of the affected joint. To do this, experiments on gene expression, methylome analysis and sequencing have been carried out together with association studies and functional in vitro experiments with chondrocytes to identify new targets. The results obtained have identified genes implicated in oxidative stress as potential therapeutic targets, distinctive methylation profiles between mitochondrial haplogroups, differential expression of the transcriptome in the disease and the interaction of mitochondrial clusters with nuclear polymorphisms and their functional consequences.[Resumo] A artrose é a enfermidade reumática máis prevalente e invalidante a nivel mundial e actualmente non existe un tratamento efectivo. Inicialmente maniféstase a nivel molecular xerando logo alteracións anatómicas e/ou fisiolóxicas. O papel da epixenética é crucial para comprender a interacción xen-ambiente nas enfermidades complexas e recentemente, relacionáronse diferentes patróns de metilación coa artrose. Doutra banda, a mitocondria tomou un papel importante pola súa importancia na detoxificación celular e os haplogrupos mitocondriales demostraron a súa influencia na predisposición e progresión da enfermidade. Este estudo centrouse na procura de novas rexións xénicas relacionadas co estrés oxidativo cun valor potencial como dianas terapéuticas ou biomarcadores da enfermidade e independentes á articulación afectada. Para iso, realizáronse experimentos de expresión xénica, análise do metiloma e secuenciación xunto con estudos de asociación e funcionais in vitro con condrocitos para identificar novas dianas. Os resultados obtidos identificaron xenes implicados no estrés oxidativo como potenciais dianas terapéuticas, perfís de metilación distintivos entre haplogrupos mitocondriais, a expresión diferencial do transcriptoma na enfermidade e a interacción dos clusters mitocondriais con polimorfismos nucleares e as súas consecuencias funcionais.[Resumen] La artrosis es la enfermedad reumática más prevalente e invalidante a nivel mundial y actualmente no existe un tratamiento efectivo. Inicialmente se manifiesta a nivel molecular generando luego alteraciones anatómicas y/o fisiológicas. El papel de la epigenética es crucial para comprender la interacción genambiente en las enfermedades complejas y recientemente, se han relacionado diferentes patrones de metilación con la artrosis. Por otro lado, la mitocondria ha tomado un papel importante por su importancia en la detoxificación celular y los haplogrupos mitocondriales han demostrado su influencia en la predisposición y progresión de la enfermedad. Este estudio se ha centrado en la búsqueda de nuevas regiones génicas relacionadas con el estrés oxidativo con un valor potencial como dianas terapéuticas o biomarcadores de la enfermedad e independientes a la articulación afectada. Para ello, se han realizado experimentos de expresión génica, análisis del metiloma y secuenciación junto con estudios de asociación y funcionales in vitro con condrocitos para identificar nuevas dianas. Los resultados obtenidos identificaron genes implicados en el estrés oxidativo como potenciales dianas terapéuticas, perfiles de metilación distintivos entre haplogrupos mitocondriales, la expresión diferencial del transcriptoma en la enfermedad y la interacción de los clusters mitocondriales con polimorfismos nucleares y sus consecuencias funcionales

Caracterización de variantes genéticas en regiones reguladoras que afectan a la respuesta a hipoxia y su papel en enfermedades respiratorias obstructivas crónicas

Tesis doctoral inédita leída en la Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Medicina, Departamento de Bioquímica. Fecha de lectura: 16-12-2015Las variantes genéticas en regiones no codificantes del genoma pueden alterar la regulación de la expresión génica y, como consecuencia, tener múltiples efectos funcionales. De acuerdo con esta posibilidad, resultados previos del laboratorio demostraron que un polimorfismo de un único nucleótido (SNP) en el sitio de unión del Factor Inducible por Hipoxia (HIF) puede alterar la inducción de genes específicos de hipoxia. Por otro lado, en enfermedades respiratorias, como la Enfermedad Pulmonar Obstructiva Crónica (EPOC) y el Síndrome de Apnea Obstructiva del Sueño (SAOS) la respuesta celular a hipoxia y por tanto la expresión génica regulada por HIF se encuentra activada en estos pacientes. Estas enfermedades tienen un origen multifactorial y presentan una evolución y pronóstico variable en función de la presencia de comorbilidades. Las causas de la evolución variable, incluida la aparición de comorbilidades, son desconocidas pero podría deberse a la diferente predisposición genética. En este trabajo estudiamos la variación genética en sitios de unión de HIF y su asociación con los diferentes fenotipos y comorbilidades en pacientes de EPOC y SAOS. Para ello, integramos datos experimentales de sitios de unión de HIF identificando 283 regiones del genoma que unen HIF. Posteriormente, estudiamos mediante secuenciación masiva de segunda generación (NGS) estas 283 regiones en muestras genómicas de 96 pacientes con EPOC y 144 pacientes con SAOS. Este análisis nos permitió identificar 72 variantes genéticas que alteran el núcleo central de unión de HIF, el motivo RCGTG. Para estudiar el efecto funcional de estas variantes, seleccionamos el SNP rs150921338 que se localiza en el promotor de PGK1 y el SNP rs6593210 en una región intrónica de EGFR y analizamos su efecto en la expresión de estos genes. Nuestros resultados, demuestran que estas variantes suprimen la inducción génica de estos genes por hipoxia. Además, mediante la edición del genoma con el sistema CRISPR/Cas9, pudimos confirmar que el SNP rs6593210 destruye un HRE funcional que controla la inducción de EGFR por hipoxia en la línea celular HEK293T. Por último, estudiamos la asociación entre las variantes genéticas identificadas y los diferentes fenotipos y comorbilidades de las enfermedades estudiadas. Nuestros resultados, pendientes de validación en una cohorte de pacientes independiente, sugieren que la variante genética rs118151281 se asocia con una mayor probabilidad de padecer hipertensión arterial y riesgo cardiovascular en pacientes de EPOC; y que el SNP rs1730190 y rs1657290 se asocia con una menor presencia de hipertensión arterial en pacientes de SAOS. En conjunto estos resultados sugieren que la variabilidad genética en motivos RCGTG en regiones no codificantes afecta la respuesta génica a la hipoxia y podría contribuir a la heterogeneidad observada en la evolución de enfermedades respiratorias crónicasGenetic variations in non-coding regions can modify gene expression and, as a consecuence, lead to multiple functional effects. Previous results of our laboratory showed that single nucleotide polymorphism (SNP) in hypoxia inducible factor (HIF) binding sites could disrupt transcriptional gene induction in hypoxia. On the other hand, it is known that in respiratory diseases, such as Chronic Obstructive Pulmonary Disease (COPD) and Obstructive Sleep Apnea Syndrome (OSAS), hypoxic cellular response is activated and gene regulation mediated by HIF is triggered in these patients. These diseases have a multifaceted nature and show a variable prognosis and evolution according to the comorbidities. The causes of such heterogeneity, including the development of comorbidities, are unknown but could be due to different genetic background. In this study, we examined genetic variation in HIF binding sites and its association with phenotypes and comorbidities in COPD and OSAS patients. To do this, we integrated experimental data of HIF binding sites identifying 238 HIF binding regions in the genome. Subsequently, we studied by massive second-generation sequencing (NGS) these 238 regions in genomic samples of 96 COPD and 144 OSAS patients. This analysis allowed us to identify 72 genetic variants modifying the central core of HIF binding site, RCGTG motif. To study the functional effect of these variants, we selected SNP rs150921338 that localize in the promoter region of PGK1 and SNP rs6593210 in an intronic region of EGFR and we analyzed their effect the expression of these genes. Our results show that these genetic variants preclude gene induction in hypoxia. We confirmed through gene editing by CRISPR/Cas9 system, that SNP rs6593210 destroys the functional HRE that controls EGFR expression in hypoxia in HEK-239T cell line. On the other hand, we studied associations between identified genetic variants and phenotypes or comorbidities of the studied diseases. Our results, pending validation in a separate cohort of patients, suggest that the variant rs118151281 associates with a higher risk of arterial hypertension and cardiovascular risk in COPD patients, and SNP rs1730190 y rs1657290 associates with a lower risk of arterial hypertension in OSAS patients. Altogether, these results suggest that genetic variation in RCGTG motifs in non-coding regions could affect genetic response to hypoxia and could contribute to the observed heterogeneity in the evolution of chronic respiratory disease

XIV Congreso Colombiano y VIII Congreso Internacional de Genética Humana

La edición XIV del Congreso Colombiano y VIII Internacional de Genética Humana, fue organizada por la Asociación Colombiana de Genética Humana (ACGH) y la Universidad Industrial de Santander (UIS), se llevó a cabo en el campus principal de la UIS, del 26 al 29 de octubre de 2016. El evento generó un espacio para el fomento, promoción y discusión de diferentes tópicos de la genética y para ello se diseñaron 10 simposios que reunieron los temas de mayor impacto en investigación genética en la actualidad: Cáncer, Genética Aplicada, Epigenética, Genética de Poblaciones, Genética Clínica, Genética Forense, Errores innatos del metabolismo, Genética de la conservación, Inmunogenética y Enfermedades Complejas

Efecto de mindfulness sobre variables psicológicas y biológicas en meditadores de larga duración

Mindfulness se ha descrito como una conciencia que emerge al enfocarse intencionalmente en la experiencia presente de una manera no crítica o evaluativa. Actualmente numerosos estudios demuestran la eficacia de mindfulness en la mejora de la calidad de vida y del bienestar psicológico en personas sanas, así como en el tratamiento de enfermedades psiquiátricas y médicas. Además, estudios recientes muestran los resultados que produce la práctica de mindfulness en variables biológicas, incluso a nivel funcional y anatómico. Sin embargo, los mecanismos psicológicos subyacentes a esta relación potencial son desconocidos. El objetivo principal de esta tesis es medir los efectos de mindfulness en variables psicológicas y biológicas en meditadores de larga duración. Para ello se llevaron a cabo dos estudios. El objetivo del primer estudio realizado fue replicar y fortalecer la hipótesis de que la meditación está asociada con la conservación de la longitud de los telómeros. Para observar este efecto y poder entender los mecanismos psicológicos subyacentes a esta posible relación, se comparó la longitud de los telómeros de un grupo de 20 meditadores expertos con un grupo pareado de 20 participantes sanos no meditadores. Se utilizaron múltiples variables psicológicas relacionadas con la práctica de la meditación que podrían estar involucradas en retrasar el proceso de envejecimiento. El ADN (ácido desoxirribonucleico) genómico se extrajo para la medición de los telómeros, utilizando un programa patentado de Life Length. Se usó hibridación cuantitativa fluorescente in situ de alto rendimiento (HT-Q-FISH) para medir la distribución de la longitud de los telómeros y la mediana de la longitud telomérica (MTL). El grupo de meditadores tuvo una MTL más larga (p = 0.005) y un porcentaje menor de telómeros cortos en células individuales (p = 0.007) que los del grupo de comparación. Tanto en la medida de la MTL como en el porcentaje de telómeros cortos, los siguientes tres factores fueron significativos: edad, ausencia de evitación experimental y subescala de Humanidad Común de la Escala de Autocompasión. El objetivo del segundo estudio realizado fue identificar alteraciones moleculares relacionadas con la atención plena mediante el perfil de la respuesta epigenética en meditadores de larga duración. Se realizó un cribado de metilación de ADN en todo el genoma utilizando la plataforma Illumina HumanMethylation450 en leucocitos de sangre periférica de 17 meditadores de larga duración y 17 controles pareados. Se encontraron 64 regiones diferencialmente metiladas (RDM) en meditadores en comparación con los controles, correspondientes a 43 genes. La mayoría de las RDM relacionadas con mindfulness (70,3%) estaban hipometiladas en meditadores, y el 23.4% de las RDM relacionadas con la atención plena se agrupaban en regiones cromosómicas teloméricas. Notablemente, casi la mitad de las RDM relacionadas con mindfulness (48.4%) involucraron genes vinculados a enfermedades humanas comunes. Aunque estos estudios tienen como limitación un tamaño de muestra reducido, los resultados sugieren que la ausencia de evitación experimental de emociones y pensamientos negativos es parte integral de la conexión entre la meditación y los telómeros, y sugieren también que existe una asociación consistente de la práctica de meditación a largo plazo con una pérdida predominante de la metilación de CpG en distintas regiones genómicas.Mindfulness refers to an awareness that emerges by intentionally focusing on the present experience in a nonjudgmental or evaluative manner. Nowadays numerous studies prove the effectiveness of mindfulness in improving the quality of life and psychological well-being in healthy people, as well as in the treatment of psychiatric and medical diseases. In addition, recent studies show the results produced by the practice of mindfulness in biological variables, even at functional and anatomical levels. However, the psychological mechanisms underlying this potential relationship are unknown. The main objective of this thesis is to measure the effects of mindfulness on psychological and biological variables in long-term meditators. To address this objective, two studies were carried out. The aim of the first study was to replicate and strengthen the hypothesis that meditation is associated with longer telomeres. To elucidate the psychological mechanisms underlying this potential relationship, we compared a group of 20 expert meditators with a matched comparison group of 20 non- meditators healthy subjects. Several questionnaires to assess different psychological constructs related to meditation that could be involved in delaying the ageing process were used. Genomic DNA was extracted for telomere measurement using a Life Length proprietary program. High-throughput quantitative fluorescence in situ hybridization (HT-Q-FISH) was used to measure the telomere length distribution and the median telomere length (MTL). The meditators group had a longer MTL (p = 0.005) and a lower percentage of short telomeres in individual cells (p = 0.007) than those in the comparison group. Both in the measure of MTL and in the percentage of short telomeres, the following three factors were significant: age, absence of experiential avoidance, and Common Humanity subscale of the Self Compassion Scale. The aim of the second study was to identify molecular alterations related to mindfulness by profiling the epigenetic response in long-term meditators. We performed a genome-wide screen of DNA methylation by using the Illumina HumanMethylation450 platform in peripheral blood leukocytes from 17 long-term meditators and 17 matched controls. 64 differentially methylated regions (DMRs) in meditators compared to controls were found, corresponding to 43 genes. Most of the mindfulness-related DMRs (70.3%) were hypomethylated in meditators, and 23.4% of mindfulness-related DMRs clustered in telomeric chromosomal regions. Notably, almost half of the mindfulness-related DMRs (48.4%) involved genes linked to common human diseases. Although both studies are limited by a small sample size, results suggest that the absence of experiential avoidance of negative emotions and thoughts is integral to the connection between meditation and telomeres, and also suggest that there is a consistent association of long-term meditation practice with a predominant loss of CpG methylation in distinct genomic regions.<br /

Integración de ómicas para la identificación de nuevos genes de susceptibilidad hereditaria a cáncer colorrectal

El cáncer colorrectal es una de las neoplasias con mayor incidencia y mortalidad a nivel mundial. La heredabilidad de esta enfermedad se estima en hasta un 35%; sin embargo, las estrategias empleadas hasta el momento solo han conseguido explicar un pequeño porcentaje de esta. En este trabajo de Tesis Doctoral se integran datos de ADN, ARN y epigenoma, a nivel germinal y tumoral, de pacientes enriquecidos genéticamente por un diagnóstico temprano de cáncer colorrectal. La identificación de nuevos genes candidatos de susceptibilidad a esta neoplasia contribuirá a explicar parte del riesgo heredado a desarrollar la enfermedad, aumentando el conocimiento sobre las bases hereditarias de cáncer colorrectal

Identificación de biomarcadores circulantes con valor pronóstico y predictivo de respuesta en cáncer de mama triple negativo

Introducción: El cáncer de mama triple negativo se caracteriza porque las pacientes que alcanzan una respuesta patológica completa a la quimioterapia neoadyuvante presentan mejor pronóstico. Sin embargo, las pacientes refractarias o pobremente respondedoras a la quimioterapia neoadyuvante presentan una peor supervivencia. Todo ello hace que sea de vital importancia la identificación temprana de estas pacientes, para tratar de alterar la secuencia de tratamiento pasando inicialmente a cirugía o valorar otras alternativas terapéuticas. Diseño: En el trabajo se ha combinado la metabolómica, los miARNs en exosomas circulantes y la citometría de flujo como aproximaciones experimentales para el estudio de biomarcadores circulantes en sangre periférica al diagnóstico en una cohorte de pacientes con cáncer de mama triple negativo candidatas a tratamiento con quimioterapia neoadyuvante. Los datos se completaron con la inmunohistoquímica en la biopsia tumoral al diagnóstico, previo al tratamiento, para generar modelos predictivos de respuesta a la quimioterapia neoadyuvante combinado con variables clínicas. Resultados: Los biomarcadores circulantes estudiados en sangre periférica han mostrado un perfil inmunosupresor relacionado con los metabolitos derivados de la vía del triptófano. Los niveles de células tempranas inmunosupresoras de origen mieloide (e-MDSCs) significativamente predicen la respuesta a la quimioterapia neoadyuvante. A su vez, la expresión de IDO1 en las células tumorales se correlaciona inversamente con los niveles circulantes de triptófano pero directamente con los niveles de e-MDSCs. Además, los miARNs en exosomas circulantes presentaban como diana vías relacionadas con la inmunidad que también permiten identificar las pacientes pobremente respondedoras al tratamiento. Conclusiones: Nuestros hallazgos muestran que las vías supresoras del sistema inmune juegan un papel importante en la respuesta a la quimioterapia neoadyuvante en el cáncer de mama triple negativo y proporcionan una potente herramienta para identificar a las pacientes pobremente respondedoras para ofrecerles estrategias de tratamiento diferentes, incluyendo una cirugía temprana o explorando vías alternativas como tratamientos de inmunoterapia